熒光壽命測(cè)量頻域法和時(shí)域法的原理

熒光壽命測(cè)量原理

熒光壽命是衡量一個(gè)熒光基團(tuán)激發(fā)態(tài)通過(guò)發(fā)射光子回到基態(tài)的時(shí)間。熒光壽命的范圍可以從皮秒到幾百納秒。下面列出一些常見(jiàn)物質(zhì)的的熒光強(qiáng)度和熒光壽命。

一個(gè)處于激發(fā)態(tài)的物質(zhì)，當(dāng)其返回基態(tài)，光子數(shù)衰減到原來(lái)的1/e，或36.8%，所經(jīng)歷的時(shí)間即為熒光壽命：

如熒光強(qiáng)度衰減圖（圖1）所示，熒光壽命t是熒光強(qiáng)度衰減到原來(lái)1/e的時(shí)間。熒光強(qiáng)度與衰減時(shí)間的函數(shù)：

I（t）是指時(shí)間為t時(shí)的熒光強(qiáng)度，α是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)系數(shù)，τ是時(shí)間壽命。

了解熒光壽命的基本理論對(duì)于理解利用熒光壽命進(jìn)行定量分析的方法是非常重要的。

目前測(cè)定熒光強(qiáng)度的方法主要有“時(shí)域法”和“頻域法”兩種。

時(shí)域法

所謂時(shí)域法，就是一定發(fā)射強(qiáng)度的短脈沖光照射樣品，并記錄時(shí)間。短脈沖光以前使用的是閃光燈，分辨率可以達(dá)到幾個(gè)納秒。現(xiàn)在用的是激光光源，分辨率可以達(dá)到皮秒或更短。

圖1。表示的短脈沖光激發(fā)下的熒光熒光的衰減圖。

如果用場(chǎng)波長(zhǎng)的激發(fā)光激發(fā)，熒光強(qiáng)度和壽命是一個(gè)單指數(shù)關(guān)系，這時(shí)壽命可以也可以用曲線的斜率直接測(cè)定。如果壽命時(shí)間和激發(fā)脈沖光的分辨率比較接近，計(jì)算時(shí)間壽命必須去除“堆積”效應(yīng)。

我們正努力數(shù)學(xué)的方法研究“反堆積”對(duì)激發(fā)脈沖光的影響。可以看到的熒光衰減的曲線形狀（見(jiàn)許多章節(jié)[ 2 ]）。目前，隨著告訴脈沖激光的出現(xiàn)，這些“反堆積”過(guò)程對(duì)于大多數(shù)壽命測(cè)量已經(jīng)變得不那么重要了，盡管它們?nèi)匀淮嬖凇y(cè)量時(shí)，可以使用與壽命時(shí)間相當(dāng)?shù)墓饷}沖。

頻域法

頻域法的原理是：

E(t)and E0分別是時(shí)間在t和0的熒光強(qiáng)度，ME是調(diào)制系數(shù)，
是光束的調(diào)制頻率，圖二顯示的是熒光強(qiáng)度和熒光壽命時(shí)間的關(guān)系。

圖2 藍(lán)色是激發(fā)光譜，紅色是熒光光譜，可以顯示它相對(duì)于激發(fā)光譜的相位偏移

熒光多相位解頻的公式如下：

相位移：

這兩種關(guān)系都與衰變時(shí)間τ有關(guān)，用儀器測(cè)量解調(diào)系數(shù)和相位，在不同的調(diào)制頻率偏移（通常為15-20），數(shù)據(jù)對(duì)理論模型進(jìn)行擬合。因此利用相移和相對(duì)調(diào)制可以確定全程相位τP和全程調(diào)制τM.，如果熒光衰減是單指數(shù)，然后τP和τM將取決于調(diào)制頻率。

τP和τM和的差異主要是頻率形式，即分析方法基礎(chǔ)上的差異，包括壽命和振幅。

必須注意區(qū)分總強(qiáng)度f從到α的影響度，即之前說(shuō)的時(shí)間域。這兩個(gè)術(shù)語(yǔ)之間的關(guān)系是由：

其中J代表所有成分的總和，α指前因子，τ是這些物質(zhì)的壽命。

分析

多頻相位和調(diào)制數(shù)據(jù)通常用非線性小二乘法進(jìn)行分析，其中實(shí)際相位和調(diào)制率數(shù)據(jù)（不是壽命值）適合于單個(gè)或多個(gè)指數(shù)衰減的不同模型。

擬合的質(zhì)量是通過(guò)減少的卡方值判斷

除了使用離散指數(shù)衰減模型進(jìn)行衰減分析外，還可以選擇將數(shù)據(jù)擬合到分布模型。在這種情況下，假定發(fā)射態(tài)的激發(fā)態(tài)衰減特性實(shí)際上導(dǎo)致了大量壽命分量。下面是一個(gè)典型的壽命分布圖。單色氨酸含蛋白-人血清白蛋白。

圖三所示為頻率響應(yīng)曲線（相位和調(diào)制率VS 調(diào)制頻率）。人血清蛋白HAS在激發(fā)光源LED300nm，下，使用長(zhǎng)通320nm濾片在20℃收集發(fā)射信號(hào)。使用洛倫茲變換擬合數(shù)據(jù)（中心點(diǎn)5.4ns，寬度2.9ns，分布98%）和另一個(gè)離散擬合數(shù)據(jù)部分（t=0.51ns，分布0.02%）。這里顯示的分布是Lorentzian，而是取決于系統(tǒng)的衰減動(dòng)力學(xué)，不同類型的分布，如高斯，或不對(duì)稱分布（普朗克），可以利用。本文描述了壽命分析的方法。

應(yīng)用

熒光壽命的測(cè)定

熒光壽命是表征熒光物質(zhì)和熒光性質(zhì)的重要手段。蛋白質(zhì)的生物物理研究，例如特定的氨基酸殘基之間的距離由福斯特共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）。此參數(shù)主要不受內(nèi)部過(guò)濾效果，靜態(tài)淬火和熒光基團(tuán)的濃度變化的影響。因此有利于臨床和高通量篩選（HTS）應(yīng)用于鑒別生物樣品高背景熒光的應(yīng)用。

另外，這個(gè)參數(shù)在多路復(fù)用方面提供了更多的優(yōu)勢(shì)。區(qū)分兩個(gè)熒光基團(tuán)的能力，具有相似的光譜但不同的壽命是另一種增加測(cè)量參數(shù)的方法，例如[ 5 ]。可以利用幾種機(jī)制來(lái)開(kāi)發(fā)基于壽命的分析方法。有簡(jiǎn)單的結(jié)合分析，在結(jié)合2部分組成（一個(gè)被熒光標(biāo)記）是伴隨著參數(shù)的變化。另一種情況是猝滅釋放型分析，淬滅的物質(zhì)有低但有限的熒光，但初存在大量過(guò)剩。如果熒光化合物被釋放（與互補(bǔ)的DNA鏈結(jié)合）（分子信標(biāo)）或酶促反應(yīng)）系統(tǒng)的壽命增加。熒光共振能量轉(zhuǎn)移分析中能量傳遞效率的測(cè)量方法，為避免供體和受體之間的光譜重疊問(wèn)題，可以采用非熒光受體。

熒光壽命的測(cè)量

目前使用的大多數(shù)熒光傳感器和檢測(cè)都是基于強(qiáng)度測(cè)量的。雖然這些方法更容易實(shí)現(xiàn)，但是需要頻繁校準(zhǔn)[ 6 ]。許多基于強(qiáng)度的測(cè)量相關(guān)的難點(diǎn)，是可以規(guī)避使用壽命為基礎(chǔ)的基于壽命的測(cè)量，具有與熒光無(wú)關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。在過(guò)去的10年中，許多研究顯示了分析物敏感的熒光壽命的變化。鑒定和特征。其中一些探針列于表2中。關(guān)于基于生命周期的詳細(xì)討論監(jiān)測(cè)我們參考你在[ 6 ]章節(jié)的“終身監(jiān)測(cè)”章節(jié)。

熒光壽命成像

在熒光顯微鏡下測(cè)量探針濃度，也為熒光壽命也提供了新的機(jī)會(huì)。熒光圖像的對(duì)比度是建立在每一對(duì)探針的熒光壽命的創(chuàng)建圖像點(diǎn)。典型的例子是細(xì)胞參數(shù)的映射，如pH值、離子濃度或氧。熒光猝滅，熒光共振能量轉(zhuǎn)移，光子誘導(dǎo)能飽和轉(zhuǎn)移（寵物）。生命成像技術(shù)的生物學(xué)應(yīng)用的例子包括組織表面的掃描，光動(dòng)力療法，DNA芯片分析，體貌成像和其他（見(jiàn)例[ 7 ]）。